RIP 技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行qPCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同，如：RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等。
RIP实验步骤
一、细胞裂解（Time 30 min）
1. 收集1×10^7 细胞样品，加入1 mL PBS 洗涤细胞，4°C 1000 rpm 离心5 min 收集细胞弃上清；
2. 配制细胞裂解液（298μL RIP lysis buffer，1.5μL Protease inhibitor cocktail，1 μL RNase inhibitor） ，细胞沉淀中加入300μL裂解液后涡旋混匀，冰上放置10 min；
3. 4℃，16,100 g 离心10 min 转移上清至新的无RNase 离心管中备用。
二、Protein A/G 磁珠与抗体结合
1．将磁珠充分涡旋混匀，每组RIP 样品准备50 μL Protein A/G beads，磁珠中加入500 μL RIP wash buffer颠倒混匀洗涤，磁力架收集磁珠并去上清；
2. 向磁珠中再次加入500 μL RIP wash buffer颠倒混匀洗涤，磁力架收集磁珠并去上清；
3． 将含有磁珠的EP管从磁力架取下，加入100 μL RIP wash buffer，此为平衡好的磁珠，然后加入5μg 相应的抗体，对照组加入IgG抗体；
4．室温旋转孵育30min；
5. 短暂离心后将EP管放入磁力架并去上清；
6. 将含有磁珠的EP管从磁力架取下，加入500 μL RIP wash buffer 颠倒混匀；
7. 短暂离心后将EP管放入磁力架并去上清；
8. 重复步骤6和7，共洗涤2次；
9. 将含有磁珠的EP管从磁力架取下，加入500 μL RIP wash buffer 颠倒混匀备用。
三、免疫沉淀
1. 配制RIP免疫沉淀buffer；
| ×1 |
RIP Wash Buffer | 860 μL |
0.5 M EDTA | 35 μL |
RNase Inhibitor | 5 μL |
Total | 900 μL |
2. 将第二部分9步的EP管短暂离心后放入磁力架并去上清，加入900 μL RIP 免疫沉淀 buffer备用；
3.吸取第一部分第3步中的100μL细胞裂解液加入到上述900μL磁珠抗体复合物中，总体积为1mL；
4. 另外，吸取10μL细胞裂解液放入新的无RNase 离心管并标记为Input，-80 °C存放，与RIP后的RNA一起纯化。吸取10μL细胞裂解液放入新的无RNase 离心管，加入10 μL of 2 X SDS-PAGE loading buffer 100°C变性后SDS-PAGE并检测蛋白的表达；
5. 将1ml 磁珠-抗体-细胞裂解液复合物4°C旋转孵育8小时；
6. 短暂离心后将EP管放入磁力架并去上清；
7. 将含有磁珠的EP管从磁力架取下，加入500 μL RIP wash buffer 颠倒混匀。短暂离心后将EP管放入磁力架并去上清；
8. 重复步骤7，共洗涤6次；
四、提取RNA
1. 配制蛋白酶K buffer，每个IP样本需要150μL；
| ×1 |
RIP Wash Buffer | 126 μL |
10% SDS | 15 μL |
Proteinase K (20mg/ml) | 9 μL |
Total | 150 μL |
2. 用150μL蛋白酶K buffer重悬第三部分第8步beads；
3. 第三部分第4步里的Input中加入116μL RIP Wash Buffer，15 μL 10% SDS，9 μL Proteinase K (20mg/ml)，总体积为150μL；
4. 55℃震荡孵育30min，洗脱RNA，磁力架收集磁珠转移上清至新的无RNase 离心管中。每管中加250μL RIP wash buffer；
5. 上清加入等洗脱体积(400 μL)苯酚-氯仿-异戊醇混合液到IP和Input样品，剧烈颠倒混匀15秒；14000 rpm，4℃离心10 分钟，收集上层水相350μL，转移到新的无RNase 离心管中。上清加入400 μL氯仿，剧烈颠倒混匀15 秒；14000 rpm，室温离心10 分钟，收集上层水相300μL转移到新的无RNase 离心管中；
6. 每管加入50 μL Salt Solution I, 15 μL of Salt Solution II, 5μL Precipitate Enhancer, 及850 μL 100% ethanol 充分颠倒混匀；–80℃静置3 h 到过夜沉淀RNA 样品；
7. 4℃，16100 g 离心30 分钟，弃上清；
8. 加入1 mL 预冷的80%乙醇，4℃，14000rpm 离心15 分钟，弃上清，室温静置风干10分钟；
9. 加入30 μL RNase-free water 溶解RNA，-80℃保存。