CRISPR/Cas9作用原理
根据Cas蛋白质和参与序列的不同,将目前发现的CRISPR/Cas系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中,Ⅰ型和Ⅲ型需要多种Cas蛋白共同发挥作用,而Ⅱ型由Cas9单独参与,是研究较为深入的一种类型。在pre-crRNA转录的同时,与其重复序列互补的反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)也转录出来。Cas9首先与crRNA和tracrRNA结合形成复合物,此复合物通过与PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-蛋白-DNA复合结构,进而在与crRNA配对的序列靶点剪切双链DNA。通过人工设计这两种RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single guide RNA),通过将表达sgRNA的元件与表达Cas9的元件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,便能够对目的基因进行操作,以引导Cas9对DNA的定点切割。
CRISPR/Cas9系统的作用原理
人HEK293细胞NDFIP1基因敲除
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HEK293细胞的NDFIP1基因。筛选后挑单克隆,并通过PCR及测序检测以及Western Blot验证,成功获得NDFIP1基因敲除的纯合细胞。细胞检测结果:无菌、无支原体。培养体系:DMEM+ 10% FBS;1:3传代。