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CRISPR Cas9基因编辑细胞系

  发布时间: 2022-06-11      浏览量:547

          CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)系统是细菌在噬菌体长期选择压力下,进化出的一种有效的获得性免疫机制。CRISPR簇广泛存在于细菌和古细菌的基因组中,是一个特殊的DNA重复序列家族。其由一个前导区(leader)、多个重复序列区(repeat)和多个间隔区(spacer)构成。前导区被认为可能是CRISPR簇的启动子,重复序列区可形成发卡结构,间隔区由俘获的外源DNA组成。CRISPR簇附近存在一个多态性家族基因,编码的蛋白质均具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性,并能与CRISPR区域发生相互作用,被命名为Cas(CRISPR associated)基因。当外源DNA入侵时,在前导区的调控下,CRISPR被转录为长的RNA前体(pre-CRISPR RNA, pre-crRNA),并通过加工成为一系列含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA,然后识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。

CRISPR-示意图.jpg

CRISPR/Cas9作用原理

         根据Cas蛋白质和参与序列的不同,将目前发现的CRISPR/Cas系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中,Ⅰ型和Ⅲ型需要多种Cas蛋白共同发挥作用,而Ⅱ型由Cas9单独参与,是研究较为深入的一种类型。在pre-crRNA转录的同时,与其重复序列互补的反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)也转录出来。Cas9首先与crRNA和tracrRNA结合形成复合物,此复合物通过与PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-蛋白-DNA复合结构,进而在与crRNA配对的序列靶点剪切双链DNA。通过人工设计这两种RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single guide RNA),通过将表达sgRNA的元件与表达Cas9的元件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,便能够对目的基因进行操作,以引导Cas9对DNA的定点切割。


CRISPR系统作用原理.jpg

                                                                                                                        CRISPR/Cas9系统的作用原理

CRISPR/Cas9系统元件

        CRISPR/Cas9系统需要两个关键基因序列:gRNA和Cas9,gRNA的功能是识别目的DNA序列,并引导Cas9蛋白到目的基因序列处进行切割。gRNA序列由两部分组成:能够与目的基因匹配的序列和能够与Cas9蛋白结合的序列。Cas9是一种能切割DNA双链的核酸内切酶,在匹配的基因的PAM序列的下游3-4碱基处进行DNA双链的切割。


成功基因编辑细胞类型精选


分类细胞名称缩写
血液和淋巴系统小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7
人B淋巴母细胞HMy2.CIR
人T淋巴细胞白血病细胞HuT78
人单核细胞白血病THP-1
人慢性髓系白血病细胞K-562
人原髓细胞白血病细胞HL-60
人白血病T淋巴细胞Jurkat,   Clone E6-1
骨骼、皮肤系统小鼠黑色素瘤细胞B16
小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16-F10
人骨肉瘤细胞U-2OS
人恶性黑色素瘤细胞A375
人纤维肉瘤细胞HT-1080
消化系统小鼠结肠癌细胞CT26.WT
人回盲肠癌细胞HCT-8
人结肠癌细胞HCT116
HT-29
人结肠腺癌细胞SW480
人结直肠癌细胞LoVo
人食管鳞癌细胞KYSE-150
人胃癌细胞HGC-27
呼吸系统小鼠肺癌细胞LLC
仓鼠肺细胞V79
人正常肺上皮细胞BEAS-2B
人大细胞肺癌细胞NCI-H460
人非小细胞肺癌细胞NCI-H1299
A549
人肺鳞癌细胞SK-MES-1
NCI-H520
泌尿系统小鼠肾小球系膜细胞SV40 MES13
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12
大鼠肾细胞NRK
非洲绿猴肾细胞Vero
恒河猴肾细胞LLC-MK2
人膀胱癌细胞5637
人前列腺癌细胞PC-3
人胚肾细胞293 Cells
人肾细胞腺癌细胞786-O
ACHN
脑和神经系统小鼠垂体瘤细胞AtT-20
大鼠胶质瘤细胞C6
人胶质瘤细胞U251
人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH
内分泌系统小鼠乳腺癌细胞4T1
人乳腺癌细胞MCF-7
MDA-MB-231
生殖系统仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1
人宫颈癌细胞Hela
人卵巢癌细胞SK-OV-3
循环系统小鼠成肌细胞C2C12
大鼠成肌细胞L6
大鼠心肌细胞H9c2(2-1)




案例精选


                                                                                    人HEK293细胞NDFIP1基因敲除

             通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HEK293细胞的NDFIP1基因。筛选后挑单克隆,并通过PCR及测序检测以及Western Blot验证,成功获得NDFIP1基因敲除的纯合细胞。细胞检测结果:无菌、无支原体。培养体系:DMEM+ 10% FBS;1:3传代。

CRISPR筛选流程及数据展示 水印版.png


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