基因过表达与基因沉默是研究特定基因功能的两大技术手段。siRNA又称小干扰RNA（Small interfering RNA；或 short interfering RNA；或silencing RNA），指能引发RNA干扰效应的短双链RNA（经典结构为19nt序列特异区域+2nt 3’悬挂，一般在20-25bp，也有一些20-30bp）；可以由细胞内源产生，也可以由外源导入。通过与体内相关酶形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）降解目标mRNA，调低或抑制目标基因的表达。siRNA 于 1999 年由 David Baulcomb 实验室首次发现。2001 年，Thomas Tuschl 提出合成 siRNA 会在哺乳动物细胞中诱导 RNA 干扰 (RNAi)。

siRNA作用机理

  首先，外源性或内源性双链RNA（dsRNA）被RNaseIII（例如Dicer）切割成约21-25nt具有活性的siRNA结构。随后，Dicer将在RNA结合蛋白TRBP的帮助下将双链siRNA加载到Argonaute（AGO2）蛋白，形成复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。然后，siRNA将解开双链，其反义链与靶mRNA结合后，AGO2将特异性降解靶mRNA，从而抑制其翻译。最后，被切除的靶mRNA被释放，RISC被回收，使用相同的加载引导链再进行几轮切片。此外，siRNA可以在RNA聚合酶的作用下再次形成dsRNA，从而重新参与以上过程。

    shRNA载体构建

     shRNA，短发卡RNA（short hairpin RNA），是指插入到相应表达载体（比如慢病毒）中的针对目的基因的特定序列（经过设计和筛选的高效且特异抑制目的基因）和特定结构（由loop序列区隔开的反向重复序列），在体内启动转录，形成发卡结构，在体内的DICER及RNase作用下，形成siRNA并诱导RNA干扰抑制特定基因表达。它通常由3个元件构成：一个转录启动子，一个shRNA前体序列和一个转录终止信号。shRNA具有较强的基因沉默能力，在体内转录后经过酶切形成siRNA分子，通过与RNA干扰复合体（RISC）结合，降解特定的mRNA分子，进而对特定基因表达进行调控。shRNA技术已广泛应用于基因功能研究和基因治疗等领域。

shRNA的特点

1.靶向性强

理论上，shRNA能够对目标基因进行特异性的抑制，而不影响其他基因的表达，在基础研究和临床治疗中有着广泛的应用前景。

2.适用范围广

shRNA可以用于多种类型的细胞和生物体系中，并且能够针对多种不同的基因进行沉默。因而使得shRNA成为了研究和治疗各种疾病的重要手段。

3.操作简单

与其他基因敲除技术相比，shRNA的设计、合成和操作相对简单。通常只需要将shRNA序列克隆到质粒或病毒载体中，然后导入到细胞内即可实现基因沉默效应。

4.抑制效果持久

shRNA可以在细胞内诱导长期的基因沉默效应，其抑制效果可以持续几天甚至数周。这种特点使得shRNA成为了研究和治疗需要长期监测的疾病的重要工具。

5.可视化的细胞转染效率

通过与荧光蛋白如GFP共表达，可以快速筛选质粒转染或病毒感染阳性的目的细胞，大大提高筛选效率。

shRNA较之siRNA具有细胞内表达更稳定，抑制靶基因作用更长久并可传递给子一代等优势，解决了siRNA无长期稳定沉默目的基因的缺陷。